Sinecatechins’in HPV ile Aktive Edilen Hücre Büyümesi ve Apoptozu İndükleme Üzerindeki Etkisi
Stephen K. Tyring , MD, PhD, MBA
Yazar bilgileri Telif hakkı ve Lisans bilgileri Sorumluluk Reddi
Soyut
Arka plan: Yeşil çay kateşinleri, antiviral, anti-enfektif ve immün sistemi uyarıcı özellikler dahil olmak üzere çok çeşitli farmakolojik özelliklere sahiptir. Ayrıca, kanser gelişimine dahil olan çeşitli enzimatik ve metabolik yollar üzerinde inhibe edici etkiler göstermişlerdir. Kateşinlerin çeşitli hücre hatlarında çoğalmayı önleyici özelliklere sahip olduğu ve doğrudan virüsidal etkiye sahip olabileceği gösterilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi, dış genital ve perianal siğillerin tedavisi için yeşil çay kateşinlerinden ve diğer çay bileşenlerinden türetilen sinekateşinlerin topikal bir merhem formülasyonunu onayladı. Sinekateşinlerin insan papilloma virüsü kaynaklı dış genital ve perianal siğillerin yok edilmesindeki kesin etki mekanizması bilinmemektedir, ancak bahsedilen mekanizmalardan bir veya daha fazlasına bağlı olabilir.
Amaç: Bu çalışma, insan papilloma virüsü ile enfekte olmuş insan servikal karsinoma hücre hatlarında sinekateşinlerin büyümeyi inhibe etme potansiyelini araştırmak için yapılmıştır.
Yöntemler: Tümör hücre dizilerinin yaşayabilirliği (insan papilloma virüsü-16 ile enfekte edilmiş CaSki ve SiHa; insan papilloma virüsü-18 ile enfekte edilmiş HeLa ve C4-I), kısa süreli bir canlılık tahlilinde (48 saat) bir parametre olarak araştırıldı. Bunu, hücre canlılığı ve proliferasyonu için bir parametre olarak sinekateşinlerin sitotoksik potansiyelini belirlemek için uzun süreli bir klonojenik tahlil (12-23 gün) izledi. Bu tahlil, canlılık tahlilinde gözlenen etkinin hücre proliferasyonundaki gecikmeden mi yoksa hücre ölümüne yol açan toplam hücre sayısında bir azalmadan mı kaynaklandığını belirledi.
Sonuçlar:Toplanan verilere göre sinekateşinler, 160 ila 360 uM aralığındaki konsantrasyonlarda dört tümör hücre hattının hepsinde hücre büyümesini yüzde 50 oranında (GI50) inhibe etti. C4-I hücreleri, daha düşük bir GI50 (~34uM) ile sinekateşinlerle tedaviye en duyarlı hücrelerdi . Toplam GI, 625uM sinekateşinlerde (C4-I için 40uM) 48 saatlik bir tahlilde elde edildi ve bir saat sonra saptanabilen büyüme inhibe edici potansiyel. Klonojenik analizler, konsantrasyona bağlı bir şekilde klon sayılarında bir azalma ile sinekateşinlerin sitotoksik potansiyelini doğruladı. Sinekateşinler, 200uM’lik bir konsantrasyonda hayatta kalan HeLa hücrelerinin sayısını önemli ölçüde azaltırken, hayatta kalan SiHa hücreleri, 600uM’lik bir konsantrasyonda neredeyse tamamen ortadan kaldırıldı.
Çözüm:Sinekateşinler, hücre döngüsü deregülasyonunun aracılık ettiği apoptozun indüklenmesine atfedilebilecek dört insan papilloma virüsü ile enfekte olmuş tümör hücre hattının hepsinde büyüme inhibe edici potansiyel gösterdi. Ek olarak, bu antiproliferatif etki, dış genital ve perianal siğillerin temizlenmesine katkıda bulunabilen sinekateşinlerin genel kanser önleyici işlevine ve olası doğrudan antiviral aktivitesine katkıda bulunabilir.
Çay yapraklarının tıbbi özellikleri binlerce yıldır bilinmektedir. 1 , 2 Camellia sinensis bitkisinden üretilen çay yaprakları iki benzersiz biyoaktif bileşik içerir: flavonoidler ve metilksantinler. 3 Kafein, teobromin ve teofilin dahil olmak üzere metilksantinler, küçük miktarlarda bulunan bir grup alkaloittir. Flavonoidlerin bir alt türü olan ve kateşinler olarak da bilinen flavonoller, yeşil çayın yüzde 25 ila 35’ini oluşturan ve yararlı etkilerinin çoğundan sorumlu olan polifenolik bileşiklerdir. 2 – 4Epigallocatechin-3-gallate (EGCg), kateşinlerin önemli bir bileşenidir ve yeşil çaydan elde edilen baskın terapötik ajan olarak kabul edilir. 3 – 5 Kateşinler, yani EGCg, kanserden kardiyovasküler hastalıklara kadar uzanan kronik hastalıkların önlenmesine yardımcı olmak da dahil olmak üzere çok çeşitli faydalı etkilere sahiptir. 3
Kateşinlerin biyolojik ve farmakolojik aktivite spektrumu. Yeşil çay kateşinlerinin biyolojik ve farmakolojik özelliklerinin spektrumu, antianjiyojenik 4 , 6 – 13 aktivite, anti-enflamatuar ve immün sistemi uyarıcı 2 , 3 , 5 , 8 , 10 , 11 aktivite ve antimikrobiyal potansiyeli içerir. 14 – 22
EGCg’nin antineoplastik aktivitesi, proliferasyonu inhibe ederek ve apoptozu indükleyerek tümör hücresi büyümesini etkilemeyi içerir. 3 , 4 EGCg’nin baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom 6 ve karaciğer, 8 yumurtalık, 7 prostat, 9 , 10 meme, 11 ve servikal hücre hatlarında büyümeyi inhibe ettiği ve apoptozu indüklediği gösterilmiştir . 12 EGCg’nin antiproliferatif ve antikarsinojenik etkileri in vitro olarak akciğer kanseri hücrelerinde, 13 kolon tümörünün yanı sıra lenfoma ve lösemi hücrelerinde de gösterilmiştir . 4EGCg tarafından indüklenen tümör azalması, meme kanseri hücre dizilerinde gösterilmiştir. 11 EGCg’nin, bir insan papilloma virüsü (HPV) tip 16 ile ilişkili insan servikal karsinoma hücre dizisi CaSki’de büyümeyi inhibe etmede önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. EGCg, muhtemelen G1 fazında hücre proliferasyonunu ve CaSki hücrelerinde gen ekspresyon paternini negatif olarak etkileyerek apoptozu indükleyerek büyümeyi önemli ölçüde inhibe etti. 4 EGCg’nin mitogenezi etkilediği ve G0/G1 fazı hücre döngüsü durmasına neden olarak apoptozu indüklediği gösterilen insan prostat kanseri hücrelerinde benzer sonuçlar görülmüştür. 9 G1 fazında apoptoz indüksiyonu ve hücre döngüsü durması da yumurtalık ve karaciğer kanseri hücre hatlarında görülmüştür. 7 , 8Androjene duyarlı insan prostat karsinomu hücrelerinde, LNCaP, EGCg’nin, p53’ün kritik serin kalıntıları üzerinde fosforilasyon yoluyla stabilizasyonu yoluyla ve bir transkripsiyon düzenleyici ailesi olan nükleer faktör-κB (NF-κB) aktivitesinin negatif düzenlenmesi yoluyla apoptozu indüklediği gösterilmiştir. . 10 Karaciğer kanseri hücrelerinde p53 ekspresyonunun yukarı regülasyonu da görüldü, 8 ve meme kanseri hücrelerinde Her-2/neu sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla NF-κB seviyeleri ve aktivitesinde azalma görüldü. 11 Ek olarak EGCg, kanser tedavisi için potansiyel olarak seçici bir hedef olan telomeraz inhibisyonu ile de ilişkilendirilmiştir. 12Bununla birlikte, sinyal iletim yollarının modülasyonu, gen ekspresyonunun düzenlenmesi, apoptozun indüklenmesi, hücre çoğalmasının ve transformasyonunun inhibisyonu dahil olmak üzere araştırılan çeşitli mekanizmalara rağmen, EGCg’nin neoplastik büyümeyi inhibe etmedeki tam etki mekanizması hala belirsizdir.
EGCg aynı zamanda immün inhibitör ajanların salınımını baskılarken immün uyarıcı ajanların salınımını indükleyerek immünostimülasyonu ve antiinflamatuar yanıtları da etkiler. EGCg’nin anti-enflamatuar aktivitesi, antioksidan olmayan mekanizmaların aracılık ettiği bir antioksidan fonksiyonla ilişkili olabilir. 2 , 3 Bu, EGCg’nin sinyal iletim yollarını 8 , 10 modüle etme ve NF-κB 10 , 11 ve aktivatör protein 1 (AP-1) gibi transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini inhibe etme yeteneğini içerir. 2 EGCg’nin antioksidan işlevi, reaktif oksijen türlerini (ROS) temizleme yeteneği ile karakterize edilir, 3 , 5bu da anti-inflamatuar özelliklerini geliştirmede önemli bir rol oynar. 5 Örneğin, NF-κB aktivasyonunu inhibe etmenin aşağı akış etkisi, ana nötrofil kemoatraktanı ve enflamatuar mediatör olan interlökin-8’in (IL-8) aşağı regülasyonuyla sonuçlanır. 2 , 5 IL-8’e ek olarak EGCg, enflamatuar sinyal yollarını modüle eder ve T hücrelerinin inflamasyon bölgelerine sızmasını olumsuz etkiler. 5Ek olarak, kateşinler T lenfositlerini aktive eder ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-a) ve interferon-gama (IFN-y) salınımını indükler. Kateşinlerin immünostimülatör aktivitesi, sitokinleri serbest bırakmak için makrofajların uyarılmasını, monositlerin, dendritik hücrelerin, lenfositlerin, doğal öldürücü hücrelerin ve T-yardımcı hücrelerin toplanmasını teşvik etmeyi içerir. 2
EGCg, Escherichia coli , Staphylococcus aureus ve Trichophyton sp büyüme inhibisyonu dahil olmak üzere bakteri ve mantarlara karşı geniş bir antimikrobiyal aktivite spektrumu göstermiştir . 14 , 23 En dikkate değer olanı, EGCg gibi kateşinlerin rotavirüs, 14 enterovirüs, 14 , 24 adenovirüs, 16 , 24 insan immün yetmezlik virüsü (HIV), 17 – 19 Epstein-Barr virüsü ( EBV), 14 ve influenza A ve B. 20 – 22
Kateşinler, HIV yaşam döngüsündeki birkaç adım aracılığıyla HIV’e karşı antivirulent aktivite sergilemiştir. EGCg, yalnızca HIV bağlanmasını ve hücre girişini engellemekle kalmaz, aynı zamanda HIV-1 deoksiribonükleik asit (DNA) polimeraz ve ters transkriptazı rekabetçi bir şekilde inhibe ederek viral partikülleri ve virüs üretimini de yok eder. Viral transkripsiyon, EGCg varlığında haberci ribonükleik asit (mRNA) ifadesindeki belirgin bir azalma ile de etkilenir. 17 , 18 Ayrıca EGCg’nin herhangi bir apoptoz veya nekroz gözlenmeden HIV enfeksiyonunu ve replikasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir. 19
EGCg, ani-erken genlerin transkripsiyonunu inhibe ederek EBV viral proteininin ekspresyonunu inhibe eder, böylece EBV litik döngüsünün başlamasını önler. 14 Madin-Darby köpek böbreği (MDCK) hücrelerinde EGCg, virüsü aglütine ederek influenza A ve B virüslerinin enfektivitesini etkiledi, böylece viral partiküllerin hedef hücre reseptörlerine bağlanmasını bloke etti ve virüsün MDCK hücrelerine emilmesini önledi. 20 , 21 Enfeksiyonu önlemenin yanı sıra EGCg’nin, virüsün kaplamasının açılmasında ve viral replikasyonda önemli bir adım olan endozomların ve lizozomların asitlenmesini önleyerek virüslerin replikasyonunu inhibe ettiği de gösterilmiştir. 21 , 22
Sinekateşinler. Sinecatechins merhem, %15, yüzde 85 ila 95 kateşin içeren Camellia sinensis yeşil çay yapraklarının özünden üretilir ve EGCg yüzde 55’ten fazla birincil kateşini temsil eder (Şekil 1). 25 Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından reçeteli kullanımı onaylanan ilk botanik ajandır ve dış genital ve perianal siğillerin (EGW) topikal hasta uygulamalı tedavisi olarak kullanılması endikedir. 26 16 haftaya kadar sinüsatechins merhem (%15) ile tedavi edilen EGW’li 1.000’den fazla erkek ve kadın hastayı içeren iki Faz 3 klinik deney, tüm siğillerde (temel ve yeni ortaya çıkan siğiller) istatistiksel olarak üstün tam temizlenme oranlarıyla sonuçlandı. tedavi edilen hastalar (sırasıyla %54,9’a karşı %35,4, p <0,001). 27Ek olarak, tüm siğillerin tamamen temizlendiği tüm hastalarda siğillerin tekrarlaması değerlendirildi; tedaviden 12 hafta sonra ölçüldüğünde, sinatechins pomad ile düşük nüks oranları (%6,8) gösterildi, %15. 27 EGW tedavilerinin yalnızca temel siğillerin temizlenmesini ölçen önceki klinik çalışmalarının aksine, tüm (temel ve yeni) siğillerin temizlenmesi çok daha alakalı bir terapötik son noktayı temsil eder. 27
Şekil 1
Yeşil çay kateşinlerinin yapısı.
EGCG=epigallocatechin-3-gallate
Yeşil çay kateşinlerinin antiviral ve antikanserojenik potansiyellerinin moleküler mekanizmaları son zamanlarda çok sayıda çalışmada açıklanmış olsa da, sinekateşinlerin EGW’nin yok edilmesindeki etki mekanizması (MOA) bilinmemektedir. Antikanserojenik bir ajan olarak, yeşil çay kateşinlerinin tümör proliferasyonu, mitojenik sinyal iletimi, hücre döngüsü ilerlemesi, neoplastik hücre dönüşümü ve iltihaplanma ile ilgili farklı biyokimyasal yollara müdahale ettiği gösterilmiştir. 3 , 4 , 6 – 13 Bir antiviral ajan olarak kateşinler, ters transkriptazı ve viral transkripsiyonu inhibe etme, viral replikasyona müdahale etme ve viral partiküllerin hedef hücre reseptörlerine yapışmasını önleme yeteneği sergilemiştir. 14, 15 , 17 – 22
Sinekateşinlerin HPV-pozitif tümör hücre hatlarında büyümeyi inhibe etme potansiyelini incelemek için, dört servikal karsinoma hücre hattı sinekateşinlerle tedavi edildi. Bu çalışmanın amacı, HPV ile enfekte olmuş insan servikal karsinoma hücre hatlarında kateşinlerin büyümeyi inhibe etme potansiyelini araştırmaktı. Bu, kateşinlerin HPV-16 pozitif hücrelerin (CaSki ve SiHa) ve HPV-18 pozitif hücrelerin (HeLa ve C4-I) canlılığı üzerindeki etkisinin araştırılmasını, sinekateşinlerin servikal karsinoma hücre dizileri üzerindeki antiproliferatif etkisinin kinetiklerinin değerlendirilmesini içerir. ve canlılık deneylerinde (WST-1) gözlemlenen etkinin hücre proliferasyonundaki bir gecikmeden mi yoksa hücre ölümüne yol açan toplam hücre sayısının azalmasından mı kaynaklandığını belirleyin.
Yöntemler Çalışmada Tokyo Food Techno Co. Ltd., Tokyo, Japonya’dan üç parti yeşil çay ekstresi kullanıldı. Ayrıca, farklı tedarikçileri karşılaştırmak için, Honson Industries Ltd. (Markham, Kanada), Wuxi (Wuxi Green Power BioProduct Ltd., Jiangsu Eyaleti, Çin), Amax NutraSource Inc (California, ABD) ve Emil Flachsmann AG’den yeşil çay özleri (Wädenswil, İsviçre) test edildi (parti numaraları ve bileşim için bkz.tablo 1). Sinecatechins ilaç maddesi bu yeşil çay ekstraktlarından sentezlendi. Sinecatechins hesaplamaları için 400 g/mol’lük bir moleküler ağırlık varsayılmıştır ve %0.9 NaCl içinde 100 mM’lik bir konsantrasyona kadar çözülmüştür. Uygun hücre kültürü ortamı kullanılarak ayrıca seyreltildi.
TABLO 1
Deneylerde kullanılan yeşil çay ekstresi partilerinin bileşimi
ND=belirlenmemiş; NA=uygulanamaz
Hücrelerin yetiştirilmesi. İnsan servikal karsinoma hücre dizileri CaSki, SiHa (her ikisi de genomik HPV-16 kopyaları taşır), HeLa ve C4-I (her ikisi de genomik HPV-18 kopyaları taşır), American Type Culture Collection’dan (Manassas, Virginia, ABD) elde edildi. CaSki hücreleri, 10 mM HEPES tamponu, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal dana serumu (FCS, Invitrogen, Karlsruhe, Almanya) içeren RPMI 1640 içinde yetiştirildi. HeLa ve SiHa hücreleri, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, %1 esansiyel olmayan amino asitler (Invitrogen) içeren Dulbecco’nun değiştirilmiş Eagle ortamında (DMEM) kültürlendi. C4-I hücreleri, %10 ısıyla inaktive edilmiş FCS (Invitrogen) ile desteklenmiş Waymouth MB 752/1 ortamında kültürlendi.
Canlılık testi (WST-1).CaSki, SiHa, HeLa ve C4-I hücreleri, 96 oyuklu düz tabanlı plakalara ekilmiştir. Tohumlamadan dört saat sonra, hücreler artan sinateşin konsantrasyonları ile muamele edildi. İki gün sonra, üreticinin (Roche Diagnostics, Mannheim, Almanya) önerdiği şekilde bir WST-1 testi yapıldı. Bu kolorimetrik canlılık testi, canlı hücrelerde mitokondriyal dehidrojenazlar tarafından tetrazolyum tuzu WST-1’in bölünmesine dayalı olarak hücre canlılığını ve hücre proliferasyonunu nicelleştirir. Hücreler, WST-1 reaktifi ile 4 ila 6 saat süreyle inkübe edildi. Daha sonra, WST-1’in dönüşümü, 655 nm’lik bir referans dalga boyu ile 450 nm’de bir enzim bağlantılı immünosorbent tahlilinde (ELISA)-okuyucuda ölçüldü. Dönüştürülen reaktif miktarı canlı hücre miktarı ile orantılıdır. Testler arası değişkenlik yaklaşık yüzde 20 idi, oysa tahlil içi değişkenlik yüzde 40’a kadar çıktı. GI50 değer, dört parametreli bir sigmoid denklemi kullanılarak Windows Sürüm 9.0 için SigmaPlot 2004 tarafından hesaplanmıştır.
96 oyuklu düz tabanlı plakalara (4.5×103 hücre/kuyu) ekilen CaSki hücreleri, artan zaman periyotları için farklı konsantrasyonlarda sinekateşinlerle inkübe edildi. Ortam, 48 saatten daha kısa süre işlenen kültürlerde değiştirildi, yani tüm numunelerde toplam inkübasyon süresi 48 saatti. Bir negatif kontrol olarak hücreler, yukarıda tarif edildiği gibi sadece ortamla inkübe edildi. Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Hücreler, WST-1 reaktifi ile dört saat süreyle inkübe edildi. Numuneler üç kopya halinde analiz edildi.
Farklı yeşil çay ekstresi tedarikçilerinin ve farklı sinekateşin gruplarının analizi için CaSki hücreleri, 96 oyuklu düz tabanlı plakalarda 4.5×103 hücre/oyuk yoğunlukta tohumlandı . Yeşil çay özleri eklendi ve hücreler 48 saat süreyle yetiştirildi. Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi belirlendi.
Klonojenik analiz. Bu tahlil, canlılık tahlilinde (WST-1) gözlemlenen etkinin, hücre proliferasyonundaki bir gecikmeden mi yoksa hücre ölümüne yol açan toplam hücre sayısındaki azalmadan mı kaynaklandığını belirlemek için kurulmuştur. Bu nedenle HeLa ve SiHa hücreleri , altı oyuklu bir plakaya düşük yoğunlukta (0.8×102 hücre/kuyu) ekildi ve küçük hücre klonları gelişene kadar üç gün boyunca kültürlendi . Hücreler, iki saat boyunca %2.5 FCS içeren ortamda artan konsantrasyonlarda (0.2mM–1mM) sinatechinlerle muamele edildi. Daha sonra hücreler, sayılabilir klonlar gelişene kadar 23 güne kadar %10 FCS içeren ortamda yetiştirildi. Ortam değişimi düzenli olarak gerçekleştirildi.
Klonlar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metilen mavisi (Merck, Darmstadt, Almanya) ile lekelendi. Daha sonra plakalar birkaç kez damıtılmış su ile durulandı ve daha sonra havayla kurutuldu. Numuneler üç kopya halinde test edildi.
Sonuçlar
Sinekateşinlerin servikal karsinom hücreleri üzerindeki antiproliferatif etkisi. Sinekateşinlerin HPV-16 ve HPV-18 pozitif hücrelerin canlılığı üzerinde bir etkisinin olup olmadığını analiz etmek için iki HPV-16 pozitif (CaSki, SiHa) ve iki HPV-18 pozitif hücre hattı (HeLa, C4-I) test edildi. Dört servikal karsinom hücre hattının tümü, 48 saat süreyle artan sinateşin konsantrasyonları (2–2500uM; TFT Lot. #010612) ile inkübe edildi ve ardından hücrelerin canlılığı, bir WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Dört hücre hattının tümünün hücre büyümesi, konsantrasyona bağlı bir şekilde sinekateşinler tarafından inhibe edildi (şekil 2). Sinecatechins tarafından toplam büyüme inhibisyonu, C4-I hücreleri için 39 uM ve CaSki, SiHa ve HeLa hücreleri için 625 uM konsantrasyonda elde edildi. Yaklaşık 34uM’lik bir hesaplanmış GI50 ve 39uM’lik bir maksimum inhibe edici etki ile , C4-I hücreleri, sinekateşinlerin sitotoksik potansiyeline karşı en hassas olanlardı (Şekil 2D). CaSki, SiHa ve HeLa hücreleri, GI 50 değerleri 160µM ile 360µM arasında değiştiği için sinekateşinlerin sitotoksik potansiyeline C4-I hücrelerine göre daha az duyarlı görünüyorlardı (Şekil 2A–C). İlginç bir şekilde, hücreler azalmış miktarlarda FCS (%2.5) içeren ortam ile inkübe edildiğinde sinekateşinlerin büyümeyi inhibe etme potansiyeli artmıştır. Bu veriler, sinekateşinlerin HPV-16 ve HPV-18 pozitif servikal karsinom hücre hatları üzerindeki konsantrasyona bağlı anti-proliferatif etkisini göstermektedir.
Şekil 2
Sinekateşinlerin servikal karsinom hücreleri üzerindeki antiproliferatif etkisi. Hücreler, hücre numaralarıyla birlikte 96 oyuklu plakalara ekilmiştir. Hücreler, 48 saat boyunca artan sinateşin konsantrasyonları (TFT Lot #010612) ile inkübe edildi. Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Veriler, sigmoidal dört parametreli bir eğri denklemi (E) kullanılarak Windows Sürüm 9.0 için SigmaPlot 2004 ile değerlendirildi. Sonuçlar, üç kopyadan elde edilen ortalama ±SD’yi temsil eder ve işlenmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında canlı hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Sinekateşinlerle tedaviden sonra hücre canlılığında benzer düşüşler gösteren 2 deneyden 1’i tasvir edilmiştir. TFT=Tokyo Food Techno Co., Ltd.
İnkübasyon süresinin sinekateşinlerin büyümeyi inhibe edici etkisi üzerindeki etkisi. Sinekateşinlerin servikal karsinom hücre dizileri üzerindeki antiproliferatif etkisinin kinetiğini analiz etmek için CaSki hücreleri, 1, 2, 4, 20 ve 48 saat boyunca 78 uM ila 2.5 mM arasında değişen farklı sinateşin konsantrasyonları ile inkübe edildi. Ortam, 48 saatten daha kısa süre işlenen kültürlerde değiştirildi (yani, tüm numunelerde toplam inkübasyon süresi 48 saatti). Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Negatif kontrol olarak hücreler, yalnızca ortam ile inkübe edildi. İçinde Figür 3, sadece iki konsantrasyon, 313uM ve 625uM tasvir edilmiştir, çünkü bunlar çoğunlukla sinüs kateşinlerle değişen tedavi süresinden etkilenmiştir. Zaten bir saatlik tedavi, 313uM ve 625uM’de bir büyüme önleyici etkiyi saptamak için yeterliydi (Figür 3). Kinetik analizi, büyüme engelleme potansiyelinin daha uzun inkübasyon süreleriyle arttığını ve 48 saatte maksimuma ulaştığını gösterdi. Aynı tip deney, HeLa hücreleri kullanılarak yapıldı. Sonuç, HeLa hücrelerinin sinekateşinlerle tedaviye daha duyarlı olması ve dört saatlik bir tedaviden sonra 313 uM’de yüzde 75’lik bir inhibisyonla sonuçlanması dışında benzerdi.
Şekil 3
Sinekateşinlerin büyümeyi inhibe edici etkisinin zamana bağlılığı. 96 oyuklu plakalara ekilen CaSki hücreleri (4.5×103 hücre /oyuk), artan zaman periyotları için 78uM–2.5mM (TFT Lot #010612) arasında değişen farklı konsantrasyonlarda sinekateşinlerle inkübe edildi. Yalnızca iki konsantrasyon, 313μM ve 625μM tasvir edilmiştir çünkü bunlar çoğunlukla değişen tedavi süresinden etkilenmiştir. Ortam, 48 saatten daha kısa süre işlenen kültürlerde değiştirildi (yani, tüm numunelerde toplam inkübasyon süresi 48 saatti). Negatif kontrol olarak hücreler, sinekateşin içermeyen ortamla inkübe edildi. Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, üç kopyadan elde edilen ortalama ±SD’yi temsil eder ve işlenmemiş hücrelere kıyasla canlı hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. TFT=Tokyo Food Techno Co., Ltd.
Farklı tedarikçilerden alınan yeşil çay ekstraktının hücre büyümesi üzerindeki etkisi. Farklı tedarikçilerden alınan yeşil çay ekstraktlarının farklı büyüme engelleme potansiyeline sahip olup olmadığını incelemek için TFT’den (Tokyo Food Techno Co. Ltd., Tokyo, Japonya) üç farklı parti ve Honson Industries Ltd., Wuxi’den (Wuxi Green Power BioProduct Ltd) birer parti kullanıldı. ), Amax NutraSource Inc ve Emil Flachsmann AG test edilmiştir (bileşim için bkz.tablo 1). CaSki hücreleri, 39 uM ila 2.5 mM arasında değişen her partiden yedi farklı konsantrasyonla işlendi. 7 partiden sadece 1’i, CaSki hücrelerinin büyümesini inhibe etme potansiyelinde azalma gösterdi (Şekil 4). EGCg, yeşil çay ekstraktındaki polifenollerin ana bileşenidir. Benzer büyüme inhibisyon potansiyeli gösteren partilerde EGCg içeriği yüzde 65 ile 42 arasında değişmiştir. Sadece Flachsmann’dan (#3024496) alınan numunede EGCg içeriği (%16) ve kateşinlerin toplam içeriği (%44,6) büyük ölçüde azaldı. Bu numunede de azaltılmış bir büyüme önleyici etki tespit edildi.
Şekil 4
Farklı tedarikçilerden alınan yeşil çay özlerinin servikal karsinom hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi. CaSki hücreleri, 96 oyuklu plakalara ekildi (4.5×10 3 hücre/oyuk) ve farklı tedarikçilerden (TFT Lot #010612, TFT Lot #020117, TFT Lot #010620, Honson Lot #030226, Wuxi Lot #) artan konsantrasyonlarda sinekateşinlerle inkübe edildi SO30126.3, Amax NutraSource Inc. Parti #GTE50/2-A010101, Flachsmann Parti #3024496) 48 saat. Canlılık, WST-1 tahlili kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, üç kopyadan elde edilen ortalama ±SD’yi temsil eder ve işlenmemiş hücrelere kıyasla canlı hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. TFT=Tokyo Food Techno Co., Ltd.
Klonojenik bir analiz kullanılarak sinekateşinlerin hücre büyümesi üzerindeki etkisi. Canlılık analizlerinde (WST-1) gözlenen etkinin hücre proliferasyonundaki bir gecikmeden mi yoksa hücre ölümüne yol açan toplam hücre sayısındaki azalmadan mı kaynaklandığını belirlemek için bir klonojenik analiz gerçekleştirildi. HPV-16 ve HPV-18 pozitif servikal karsinom hücre dizileri (sırasıyla SiHa ve HeLa) altı oyuklu plakalara ekildi ve iki saat süreyle artan sinüskateşin konsantrasyonları ile işlendi. Daha sonra ortam, sinekateşinleri çıkarmak için değiştirildi ve hücreler, sırasıyla HeLa ve SiHa hücreleri için 17. Güne ve 23. Güne kadar inkübe edildi.
Klon sayısı, artan sinekateşin konsantrasyonları ile her iki hücre hattında da bir azalma ortaya çıkardı (Şekil 5). HeLa hücreleri için klon sayılarındaki en yüksek düşüş, analiz edilen sinekateşinlerin en düşük konsantrasyonu olan 200uM’de gözlendi. Klon sayıları yaklaşık 50’den 10 klona düştü. Daha yüksek sinüs kateşin konsantrasyonları (1 mM’ye kadar) kullanılarak klon sayılarında daha fazla tespit edilebilir bir düşüş olmamıştır. SiHa hücrelerinde sinekateşinlerle tedavi, artan ilaç konsantrasyonuyla birlikte klon sayılarında daha sabit bir düşüşle sonuçlandı.
Şekil 5
Sinecatechins’in bir klonojenik analiz kullanılarak HPV16- (SiHa) ve HPV18-(HeLa) pozitif servikal karsinoma hücreleri üzerindeki etkisi. Altı kuyucuklu plakalarda tohumlanan hücreler (0.8×10 2hücreler/oyuk) 3. Güne kadar büyütüldü. Daha sonra, %2.5 FCS içeren ortamda iki saat boyunca artan sinüs kateşin konsantrasyonları (TFT Lot #020117) ile inkübe edildi. Ortam değiştirildi ve hücreler, 13. Güne (HeLa) veya 23. Güne (SiHa) kadar %10 FCS içeren sinekateşinler içermeyen taze ortamda inkübe edildi. Metilen mavisi ile lekelendikten sonra tekli klonlar sayıldı. Sonuçlar, kopyalardan (HeLa) veya üçlü kopyalardan (SiHa) ortalama ±SD’yi temsil eder. Bu deney, sinekateşinlerle muameleden sonra klon sayılarında aynı azalmayı gösteren farklı hücre sayıları ile iki kez yapıldı. TFT=Tokyo Food Techno Co., Ltd. FCS=fetal buzağı serumu.
600uM sinekateşinler ile klonların neredeyse tamamen ortadan kaldırılması sağlandı (Şekil 5). Deney farklı hücre sayıları ile tekrarlandı ve servikal kanser hücre dizilerinde sinatechinlerin uzun süreli sitotoksik potansiyelini gösteren aynı etki saptandı. Böylece sinekateşinler hücre çoğalmasını geciktirmekle kalmaz, aynı zamanda hücre ölümüne de yol açar.
Tartışma
Kateşinlerin HPV ile enfekte olmuş insan servikal karsinoma hücre hatlarında büyümeyi inhibe etme potansiyelini incelemek için sinekateşinler, iki HPV-16 pozitif (CaSki ve SiHa) ve iki HPV-18 pozitif (HeLa ve C4-I) servikal hücre hattına karşı incelenmiştir. Sinecatechins, 160 ila 360µM arasındaki konsantrasyonlarda serviks kanseri hücre hatları CaSki, SiHa ve HeLa’nın hücre büyümesini yüzde 50 oranında inhibe etti. Genel olarak, dört hücre hattının tümünün hücre büyümesi, sinateşinler tarafından konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe edildi. C4-I hücreleri, bir GI 50 gösteren sinekateşinlerle tedaviye en duyarlıydı.yaklaşık 34uM, maksimum inhibitör etkisi 39uM. CaSki, SiHa ve HeLa hücreleri için 625uM’de ve C4-I hücreleri için 39uM’de toplam inhibisyon sağlandı. Büyüme inhibisyon kinetiğinin analizi, etkinin zamanla arttığını ve 48 saatte maksimuma ulaştığını gösterdi. Ayrıca, EGCg içeriği yüzde 42 ila 65 arasında değişen yeşil çay özleri, 48 saatlik bir analizde büyümeyi engelleme potansiyelinde hiçbir fark göstermedi. Yalnızca %16 EGCg içeren Flachsmann partisi, büyük ölçüde azaltılmış büyüme önleyici etki gösterdi. Klonojenik deney, hücre büyümesi üzerindeki inhibitör etkiyi doğruladı ve sinekateşinlerin sadece metabolik aktiviteyi inhibe edemediğini, aynı zamanda hücre ölümüne de yol açtığını gösterdi.
Bu çalışmada tümör hücre dizilerinin hücre büyümesini etkileyen sinekateşinlerin konsantrasyon aralığı, başkaları tarafından bildirilen bulgularla uyumludur. 4 , 12 , 28 Ahn ve diğerleri 4, EGCg’nin 1 ila 2 günlük bir tahlilde yaklaşık 35uM’lik bir GI50 ile CaSki hücrelerinin büyümesini inhibe ettiğini gösterdi. Yokohama ve diğerleri 12, yedi günlük bir tedaviden sonra 100uM’de SiHa hücrelerinde hücre büyümesinde yüzde 50’lik bir azalma ( p <0.01) ve HeLa hücrelerinde dört gün sonra 100uM’de yüzde 25’lik bir inhibisyon bildirdi ( p <0.05). Morré ve arkadaşları 28, 72 saatlik bir tahlilde HeLa büyümesinin inhibisyonu için yaklaşık 2 uM’lik bir GI50 gösterdi . GI’deki farklılıklar50 değerleri inkübasyon süresindeki farklılıklardan, hücre yoğunluğundaki farklılıklardan veya büyüme inhibisyonunu saptamak için kullanılan tahlildeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. İlginç bir şekilde, Morré ve ark.28 tarafından yapılan çalışma, bireysel yeşil çay kateşinleri (EGCg, GCg, ECg, EGC ve EC) test edildiğinde, EGCg’nin en güçlü olduğunu ve ardından GCG’nin geldiğini gösterdi. Bu, bir galloil grubu içeren kateşinlerin hücre canlılığını azaltmada en etkili kateşinler olduğunu gösteren mevcut çalışmadan elde edilen verilerle uyumludur. Morré ve diğerleri 28 ayrıca, hücre büyümesini inhibe etmek için gereken EGCg miktarının, EGCg ile EC arasında sinerjistik bir etki gösteren inaktif kateşin EC ile EGCg’nin kombinasyonu ile yaklaşık 10 kat azaldığını bildirdi.
Yeşil çay ekstraktlarının büyümeyi inhibe etme potansiyeli, apoptozun indüklenmesi, hücre döngüsü durması ve telomeraz inhibisyonuna bağlanmıştır. Son makalelerde, yeşil çay kateşinlerinin in vitro tahlillerinin sitotoksik etkisinin, artan hidrojen peroksit (H 2 O 2) seviyeleri tarafından da indüklendiği söylenmiştir.) hücre kültürü ortamında. ROS üretiminin, hücre kültürü ortamında belirli koşullar altında bir oto-oksidasyon işlemi sırasında bazı polifenoller tarafından indüklendiği gösterilmiştir. Bu antioksidan fonksiyon, transkripsiyon faktörlerinin (NG-κB ve AP-1) aktivasyonu gibi, EGCg’nin anti-enflamatuar özelliklerini geliştirmede önemli bir rol oynar ve bu da enflamatuar mediatörlerin aşağı regülasyonuna neden olur. EGCg’nin antiproliferatif etkisini belirginleştiren ve genel kanser önleyici işlevine katkıda bulunan metabolik aktivite üzerindeki etkisinin, EGCg’nin antiviral aktiviteyi yönlendirmesini de mümkün kılabileceğini not etmek önemlidir.
Genel olarak, bu çalışma sinekateşinlerin servikal kanser hücrelerinin büyümesini engelleme potansiyelini göstermektedir ve bu etki, genel kanser önleyici işlevine kısmen katkıda bulunabilir. Sinekateşin ilaç maddesini sentezlemek için kullanılan yeşil çay ekstraktının çeşitli partilerinin büyümeyi engelleme potansiyellerinin benzerliği, ticari olarak temin edilebilen sinekateşinlerin aynı şekilde performans gösterdiği anlamına gelebilir. Sinekateşinlerin kesin MOA’sı bilinmemekle birlikte, bilinen antioksidan, immün sistemi uyarıcı ve antiproliferatif aktiviteleri, antiviral etkilerine ek olarak, EGW tedavisi için topikal uygulamasının ardından gözlemlenen yüksek etkinlik oranlarına ve düşük nüks oranlarına katkıda bulunabilir. Antioksidan aktivitenin yanı sıra FDA, ürün etiketinde herhangi bir ek aktivitenin bulunmasını onaylamamıştır. Sağlayıcı tarafından uygulanan ve hasta tarafından uygulanan EGW tedavilerinin çoğu, immün sistemi uyarıcı aktiviteye sahip olan imikimod dışında, lezyonları yok etmek için yıkıcı yöntemlere dayanır. Hasta tarafından uygulanan diğer topikal EGW terapileri (örn., imikimod, podofiloks) ile kafa kafaya çalışma yapılmamıştır; bununla birlikte, diğer tedavilerin yayınlanmış literatüründe rapor edilen EGW klirens oranları, sinekateşinlerle yapılan tedaviden sonra gözlemlenen oranlardan daha düşüktür. Daha da önemlisi, sinatechins pomad ile karşılaştırıldığında daha yüksek nüks oranları bildirilmiştir (imikimod için %13-19, kriyoterapi ile %40 ve podofiloks ile %91’e kadar yüksek), %15. Hasta tarafından uygulanan diğer topikal EGW terapileri (örn., imikimod, podofiloks) ile kafa kafaya çalışma yapılmamıştır; bununla birlikte, diğer tedavilerin yayınlanmış literatüründe rapor edilen EGW klirens oranları, sinekateşinlerle yapılan tedaviden sonra gözlemlenen oranlardan daha düşüktür. Daha da önemlisi, sinatechins pomad ile karşılaştırıldığında daha yüksek nüks oranları bildirilmiştir (imikimod için %13-19, kriyoterapi ile %40 ve podofiloks ile %91’e kadar yüksek), %15. Hasta tarafından uygulanan diğer topikal EGW terapileri (örn., imikimod, podofiloks) ile kafa kafaya çalışma yapılmamıştır; bununla birlikte, diğer tedavilerin yayınlanmış literatüründe rapor edilen EGW klirens oranları, sinekateşinlerle yapılan tedaviden sonra gözlemlenen oranlardan daha düşüktür. Daha da önemlisi, sinatechins pomad ile karşılaştırıldığında daha yüksek nüks oranları bildirilmiştir (imikimod için %13-19, kriyoterapi ile %40 ve podofiloks ile %91’e kadar yüksek), %15.27
Çözüm
Yeşil çayın deneysel karsinojenez ve viral replikasyon ve inhibisyona karşı inhibitör etkileri , çeşitli çalışmalarda in vitro ve/veya in vivo olarak gösterilmiştir . Antineoplastik ajanlar olarak, kateşinlerin hücre büyümesini inhibe ettiği ve birkaç insan karsinoma hücresinde apoptoza yol açtığı tarif edilmektedir. Bununla birlikte, antiviral ajanlar olarak kateşinlerin, viral yaşam döngüsünün çeşitli aşamalarında bozulma yoluyla viral replikasyonu inhibe ettiği ve hemaglütinasyon gibi süreçler yoluyla enfektiviteyi önlediği gösterilmiştir. Antikanserojenik süreçlerin aksine, kateşinlerin antiviral yeteneği apoptoz veya nekroza atfedilmemiştir. in -vitroBu çalışmada gösterilen sinekateşinlerin aktivitesi, EGW’nin temizlenmesi ile ilgili olduğu için MOA’sı hakkında ek bilgi sağlar.
Teşekkür
Yazar, MediGene AG, Planegg/Martinsried, Almanya ve çalışanlarına bu el yazmasında sunulan çalışmayı finanse ettikleri ve yürüttükleri için minnetle teşekkür eder. Yazar ayrıca PA-C’den Priya Karkhanis ve Malik Cobb’a yazma ve editörlük yardımlarını minnetle kabul eder.
Dipnotlar
AÇIKLAMA: Dr. Tyring, Fougera Pharmaceuticals Inc.’in bir bölümü olan PharmaDerm® sponsorluğunda araştırmacı tarafından başlatılan klinik deneyler yürütmüştür.
REFERANSLAR
1. Cooper R, Morré DJ, Morré DM. Yeşil çayın tıbbi faydaları: Bölüm I Kanser dışı sağlık yararlarının gözden geçirilmesi. J Alternatif Tamamlayıcı Med. 2005; 11 (3):521–528. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
2. Meltzer SM, Monk BJ, Tewari KS. Dış genital siğillerin tedavisi için yeşil çay kateşinleri. Ben J Obstet Gynecol. 2009; 200 (3):233.e1–233.e7. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
3. Balentine DA, Wiseman SA, Bouwens LC. Çay flavonoidlerinin kimyası. Crit Rev Food Sci Nutr. 1997; 37 (8):693–704. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
4. Ahn WS, Huh SW, Bae SM ve ark. Yeşil çayın önemli bir bileşeni olan EGCg, apoptoz, G1 tutuklaması ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi yoluyla bir insan servikal hücre dizisi olan CaSki hücrelerinin büyümesini engeller. DNA Hücre Biol. 2003; 22 (3):217–224. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
5. Rahman I, Biswas SK, Kirkham PA. Diyet polifenolleri ile iltihaplanma ve redoks sinyalinin düzenlenmesi. Biochem Eczacılık. 2006; 72 (11):1439–1452. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
6. Masuda M, Suzui M, Weinstein IB. Epigallocatechin-3-gallat’ın insan baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom hücre hatlarında büyüme, epidermal büyüme faktörü reseptörü sinyal yolları, gen ekspresyonu ve kemosensitivite üzerindeki etkileri. Klinik Kanser Arş. 2001; 7 (12):4220–4229. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
7. Huh SW, Bae SM, Kim YW ve diğerleri. (-)-Epigallocatechin-3-gallat’ın yumurtalık karsinomu hücre dizileri üzerindeki antikanser etkileri. Jinekol Onkol. 2004; 94 (3):760–768. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
8. Kuo PL. Lin CC. Yeşil çay bileşeni (-)-epigallocatechin-3-gallate, Hep G2 hücre proliferasyonunu inhibe eder ve p53’e bağlı ve Fas aracılı yollar yoluyla apoptozu indükler. J Biomed Sci. 2003; 10 (2):219–227. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
9. Gupta S, Ahmad N, Nieminen AL, Mukhtar H. Androjene duyarlı ve androjene duyarlı olmayan insan prostat karsinomunda yeşil çay bileşeni (-)-epigallocatechin-3-gallate tarafından büyüme inhibisyonu, hücre döngüsü düzensizliği ve apoptozun indüksiyonu hücreler. Toksikol Uygulaması Pharmacol. 2000; 164 (1):82–90. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10. Hastak K, Gupta S, Ahmad N, et al. LNCaP hücrelerinin epigallocatechin-3-gallate ile indüklenen apoptozunda p53 ve NF-κB’nin rolü. onkojen. 2003; 22 :4851–4859. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11. Pianetti S, Guo S, Kavanagh KT, Sonenshein GE. Yeşil çay polifenol epigallocatechin-3 gallate, meme kanseri hücrelerinin Her-2/neu sinyalini, proliferasyonunu ve dönüştürülmüş fenotipini inhibe eder. Kanser Arş. 2002; 62 (3):652–655. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
12. Yokoyama M, Noguchi M, Nakao Y, et al. Çay polifenol, (-)-epigallocatechin gallate, servikal hücre hatlarında büyüme, apoptoz ve telomeraz aktivitesi üzerindeki etkileri. Jinekol Onkol. 2004; 92 (1):197–204. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
13. Yang CS, Yang GY, Landau JM ve ark. Çay ve çay polifenolleri, hücre hiperproliferasyonunu, akciğer tümör oluşumunu ve tümör ilerlemesini engeller. Exp Akciğer Res. 1998; 24 (4):629–639. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
14. Chang LK, Wei TT, Chiu YF ve ark. (-)-epigallocatechin gallate tarafından Epstein-Barr virüsü litik döngüsünün inhibisyonu. Biochem Biophys Res Kom. 2003; 301 (4):1062–1068. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
15. Toda M, Okubo S, Ikigai H, et al. Çay kateşinlerinin Vibrio cholerae O1 tarafından deneysel enfeksiyona karşı koruyucu aktivitesi. Mikrobiyoloji İmmunol. 1992; 36 (9):999–1001. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
16. Weber JM, Ruzindana-Umunyana A, Imbeault L, Sircar S. Yeşil çay kateşinleri tarafından adenovirüs enfeksiyonu ve adenainin inhibisyonu. Antivir Res. 2003; 58 (2):167–173. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
17. Yamaguchi K, Honda M, Ikigai H, et al. (-)-Epigallocatechin gallate’in insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) Antivir Res. 2002; 53 (1):19–34. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
18. Nakane H, Ono K. Bazı kateşin türevlerinin, bazı kateşin türevleri tarafından insan immün yetmezlik virüsü ters transkriptaz ve hücresel deoksiribonükleik ve ribonükleik asit polimerazlar ve çeşitli DNA ve RNA polimerazların aktiviteleri üzerindeki farklı önleyici etkileri. Biyokimya. 1990; 29 :2841–2845. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
19. Fassina G, Buffa A, Benelli R, et al. Aday bir anti-HIV ajanı olarak yeşil çaydan elde edilen polifenolik antioksidan (-)-epigallocatechin-3-gallate. AIDS. 2002; 16 (6):939–941. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
20. Nakayama M, Suzuki K, Toda M, et al. İnfluenza virüsünün enfektivitesinin çay polifenolleri tarafından inhibisyonu. Antivir Res. 1993; 21 (4):289–299. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
21. Song JM, Lee KH, Seong BL. Yeşil çaydaki kateşinlerin grip virüsü üzerindeki antiviral etkisi. Antiviral Çöz. 2005; 68 (2):66–74. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
22. Imanishi N, Tuji Y, Katada Y, et al. MDCK hücrelerinde influenza A ve B virüslerinin büyümesi üzerinde çay ekstraktının ilave inhibitör etkisi. Mikrobiyoloji İmmunol. 2002; 46 (7):491–494. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
23. Okubo S, Toda M, Hara Y, Shimamura T. Trichophyton. Fujieda, Japonya: Mitsui Norin Co., Gıda Araştırma Laboratuvarları; Çay ekstresi ve kateşinlerin antifungal ve fungisidal aktivitelerine karşı. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
24. Mukoyama A, Ushijima H, Nishimura S, et al. Çay özleri ile rotavirüs ve enterovirüs enfeksiyonlarının inhibisyonu. Jpn J Med Sci Biol. 1991; 44 :181–186. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
25. Yang CS, Maliakal P, Meng X. Çay ile karsinojenezin engellenmesi. Annu Rev Pharmacol Toksikol. 2002; 42 :25–54. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
26. Veregen Ürün Monografisi. Melville, NY: PharmaDerm, Nycomed US Inc.’in Bir Bölümü; 2010.
27. Tatti S, Stockfleth E, Beutner KR, et al. Polyphenon E ® : dış anogenital siğiller için yeni bir tedavi. Br J Dermatol. 2010; 162 :176–184. [ PubMed ] [ Google Akademik ]
28. Morré DJ, Morré DM, Sun H, et al. Çay kateşin, kanser hücresi proliferasyonunun ve kansere özgü bir hücre yüzey oksidazının (ECTO-NOX) Pharmacol Toxicol’ün inhibisyonunda sinerji oluşturur . 2003; 92 (5):234–241. [ PubMed ] [ Google Akademik ]